طراحی، ساخت و بررسی کارآیی دو ناقل بیانی گیاهی (pBI121GUS-9 و pBI1213+4) با جایگاه‌های همسانه‌سازی توسعه یافته

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی ارشد گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

2 استادیار گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

3 استاد گروه زیست فرآورده‌های گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

4 دانشیار گروه زیست فناوری مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

چکیده

اکثر ناقلین دوتایی متداول در تراریختی گیاهان به واسطه آگروباکتریوم، به‌دلیل اندازه بزرگ، دارای تعداد اندکی جایگاه شناسایی منحصر به فرد آنزیم‌های برشی شناخته شده و متداول می‌باشند که این موضوع همسانه‌سازی ژن‌های موردنظر را در آن‌ها با مشکل مواجه می­کند. برای رفع این مشکل ناقل pBI1213+4،با سـه جایگـاه برشی منـحصر به فـرد جدید نسبت به ناقـل pBI121 در پایین‌دست ژن گزارشگر gus (β-glucuronidase) و همچنین ناقل pBI121GUS-9، دارای نه جایگاه منحصر به فرد آنزیم‌های برشی بین پیشبر CaMV 35S و خاتمه‌دهنده NOS (با طراحی دو آغازگر یکی در بالا دست و دیگری پایین دست خاتمه‌دهنده NOS و استفاده از آن‌ها در یک واکنش PCR)، ساخته و معرفی شدند. برای بررسی کارآیی ناقلین جدید، هم در مرحله همسانه‌سازی و هم در مرحله انتقال ژن به گیاه، ابتدا ژن گزارشگر gus در داخل این ناقلین همسانه‌سازی و سپس سازه‌های نوترکیب حاصل به گیاه مدل توتون رقم سامسون منتقل شدند. کارآیی ناقلین جدید، پس از استخراج DNA ژنومی از گیاهان تراریخته حاصل از دانهال‌های رشد یافته در محیط‌کشت انتخابی، ابتدا با انجام PCR جهت تأیید تلفیق تراژن و سپس آزمون سنجش فعالیت GUS با استفاده از روش هیستوشیمیایی برای تأیید بیان مؤثر ژن منتقل شده، ارزیابی شد. آنالیزهای مولکولی، حضور تراژن و بیان آن را در گیاهان تراریخته تأیید کردند. با تأیید کارآیی ناقلین pBI121GUS-9 و pBI1213+4در انتقال ژن گزارشگر و بیان مؤثر آن، می‌توان از آن‌ها برای انتقال ژن‌های تجاری به گیاهان استراتژیک استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Designing, Construction and Functional Analysis of Two New Plant Expression Vectors (pBI121GUS-9 and pBI1213+4) with Improved Cloning Sites

نویسندگان [English]

  • Mohammad Behzadmand 1
  • Kasra Esfahani 2
  • Ali Hatef Salmanian 3
  • Amir Mousavi 4
1 MSc Graduated, Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran
2 Assistant Professor, Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran
3 Professor, Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran
4 Associate Professor, Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran
چکیده [English]

Most popular binary vectors used in plant transformation via Agrobacterium have limeted common restriction recognition sites due to large vector size which has caused difficulties in cloning of target genes. To overcome this problem, new plant expression vectors including pBI1213+4 with three additional recognition sites downstream of gus gene and pBI121GUS-9 with nine recognition sites between CaMV 35S and Nos terminator (by using two primers designed upstream and downstream of Nos terminator in a PCR reaction) were constructed and identified. To analyze the efficiency of new vectors both in cloning and transformation steps, gus reporter gene was cloned and the new recombinant constructs were transferred to model plant Nicotiana tabbacum L. cv. Samsun via Agrobacterium tumefaciens (LBA4404). DNA was extracted from putative transgenic seedlings, which were regenerated on selective media and analyzed by PCR method. GUS assay confirmed the expression of the transgene in leaves of transgenic seedlings. After verification of the pBI1213+4 and pBI121GUS-9 in transformation and expression of the reporter gene, these vectors can be used for transformation of strategic plants with commercial transgenes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Binary vectors
  • Plant expression vector
  • Agrobacterium-mediated gene transfer
  • Transgenic plants

Angenon, G., Van Montagu, M. and Depicker, A. 1990. Analysis of the stop codon context in plant nuclear genes. FEBS letters, 271 (1-2): 144-146.

Chen, P. Y., Wang, C. K., Soong, S. C. and To, K. Y. 2003. Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Molecular Breeding, 11(4): 287-293.

Esfahani, K., Motallebi, M. and Zamani, M. R. 2012. Construction of plant expression vectors harboring chitinase (chit42) or glucanase (bgn13.1) genes from Trichoderma species, single or in combination using in plant transformation projects. Iranian Journal of Biology, 24(6): 880-894.

Gallie, D. R., Sleat, D. E., Watts, J. W., Turner, P. C. and Wilson, T. M. A. 1988. Mutational analysis of the tobacco mosaic virus 5′-leader for altered ability to enhance translation. Nucleic Acids Research, 16(3): 883-893.

Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J. and Schilperoort, R. A. 1983. A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature, 303: 179-180.

Holsters, M., De Waele, D., Depicker, A., Messens, E., Van Montagu, M. and Schell, J. 1978. Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens. Molecular and General Genetics, 163(2): 181-187.

Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W. 1987. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. The EMBO Journal, 6(13): 3901.

Komori, T., Imayama, T., Kato, N., Ishida, Y., Ueki, J. and Komari, T. 2007. Current status of binary vectors and superbinary vectors. Plant Physiology, 145(4): 1155-1160.

Kozak, M. 1991. Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. Journal of Biological Chemestry, 266(30): 19867-19870.

Lee, L. Y. and Gelvin, S. B. 2008. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology, 146(2): 325-332.

Lin, C. Y., Ku, H. M., Tan, C. W., Yeh, S. D. and Jan, F. J. 2011. Construction of the binary vector with bi-selectable markers for generating marker-free transgenic plants. Botanical Studies, 52(3): 239-248.

Mohammadhassan, R., Esfahani, K. and Kashefi, B., 2018. Constructional and Functional Evaluation of Two New Plant Expression Vectors—pBI121GUS-6 and pBI1215+1. Banat's Journal of Biotechnology, 9(17): 60-68.

Nakamura, S., Mano, S., Tanaka, Y., Ohnishi, M., Nakamori, C., Araki, M., Niwa, T., Nishimura, M., Kaminaka, H., Nakagawa, T. and Sato, Y. 2010. Gateway binary vectors with the bialaphos resistance gene, bar, as a selection marker for plant transformation. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 74(6): 1315-1319.

Rao, A. Q., Bakhsh, A., Kiani, S., Shahzad, K., Shahid, A. A., Husnain, T. and Riazuddin, S. 2009. The myth of plant transformation. Biotechnology Advances, 27(6): 753-763.

Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular cloning. Cold Spring Harbor, New York.

Sugio, T., Matsuura, H., Matsui, T., Matsunaga, M., Nosho, T., Kanaya, S., Shinmyo, A. and Kato, K. 2010. Effect of the sequence context of the AUG initiation codon on the rate of translation in dicotyledonous and monocotyledonous plant cells. Journal of Bioscience and Bioengineering, 109(2): 170-173.

Zambryski, P., Joos, PH., Genetello, C., Leemans, J., Van Montagu, M. and Schell, J. 1983. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity. The EMBO Journal, 2: 2143-2150.