بررسی اثر یک آنزیم کیتیناز کایمر روی مرحله لاروی پروانه بید آرد (.Ephestia kuehniella Zell)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد، بخش بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

2 استاد، بخش یوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

3 دکترا، بخش یوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

4 کارشناسی ارشد، بخش یوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

5 استادیار، بخش تحقیقات کنترل بیولوژیک، موسسه تحقیقات گیاه‌پزشکی کشور، تهران، ایران

چکیده

در این مطالعه، اثر افزودن دمین باند‌شونده به کیتین در افزایش فعالیت آنزیم کیتیناز42 روی مرحله لاروی پروانه بید آرد (Ephestia kuehniella Zell.) بررسی شد. ابتدا، همسانه‌سازی و بیان پروکاریوتی آنزیم کیتیناز کایمری42، از منشأ کیتیناز Trichoderma atrovoride chitinase 18-10 و آنزیم کیتیناز42 در باکتری Escherichia coli انجام شد. سپس، با روش SDS-PAGE باند بیانی تأیید شد. در ادامه، عملکرد هیدرولازی آنزیم‌های کیتیناز کایمری42 و کیتیناز42 روی پودر خشک بدن 10 عدد لارو سن آخر پروانه بید آرد اندازه‌گیری شد. در نهایت، اثر 3 غلظت (30، 45 و 60 میکروگرم در میلی‌لیتر) از آنزیم‌های مذکور بر مرگ‌ومیر لاروهای پروانه بید آرد آزمایش شد. برای هر غلظت، 30 عدد لارو (در 3 تکرار 10 تایی) در دمای 28 درجه سلسیوس، رطوبت نسبی 50 درصد، دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی تیمار شد. یک شاهد ( 10 عدد لارو تیمار شده با محلول پروتئینی استخراج شده از ناقل بیانی فاقد ژن کایمر) به‌طور هم‌زمان برای هر آنزیم در نظر گرفته شد. بعد از 24 ساعت تعداد لاروهای مرده در تیمارها شمارش و میزان مرگ‌ومیر از طریق فرمول Abbott محاسبه شد. میزان فعالیت کیتیناز کایمری و کیتیناز42 روی کیتین لارو به‌عنوان سوبسترا، به‌ترتیب 47/15 و 16/9 واحد بر میلی‌لیتر بود. هم‌چنین، اثر غلظت 60 میکروگرم در میلی‌لیتر آنزیم‌های مذکور بر مرگ‌ومیر لاروها، به‌ترتیب 65 و 47 درصد به‌دست آمد. مشاهدات میکروسکوپی نیز میزان بیش‌تر تخریب کیتین لاروی را در تیمار کیتیناز کایمری در مقایسه با کیتیناز42 اثبات کرد. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of a Chimeric Chitinase on the Larval Stage of the Mediterranean Flour Moth (Ephestia kuehniella Zell.)

نویسندگان [English]

  • Atiyeh Ataei 1
  • Mohammadreza Zamani 2
  • mostafa motallebi 2
  • Mahboobeh Ziaei 3
  • Zahra Moghaddasi Jahromi 4
  • Jalal Shirazi 5
1 MSc, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
2 Professor, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
3 PhD, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
4 MSc, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
5 Assistant Professor, Department of Biological Control Research, Iranian Research Institute of Plant Protection, Tehran, Iran
چکیده [English]

In this research, the effect of chitin binding domain was investigated on the enhancement of chitinase activity Chit42 enzyme tested on the last instar larvae of Ephestia kuehniella Zell. Chimeric chitinase containing chitin binding domain from Trichoderma atroviride 18-10 chitinase and Chit42 were cloned in pET 26b(+) and over expressed in Escherichia coli. The expressed protein was observed and verified by SDS-PAGE method. Hydrolytic activity of the chimeric and native enzymes was measured on the dry powder of 10 last instar larvae of E. kuehniella. The effect of 3 different concentrations of each enzyme including 30, 45 and 60μg/ml was evaluated on the mortality of 30 E. kuehneilla last instar larvae (each 10 larvae as 1 replication) at 28ºC, 50% RH and 16:8h L:D. Larvae were treated by protein solution lacking enzymes in control. After 24h, the number of dead larvae was counted in treatments and control. Mortality was calculated by Abbott’s formula. The chimeric chitinase and native enzymes activity on the larval chitin (substrate) was calculated to be 15.47 and 9.16U/ml, respectively. Bioassay tests demonstrated that the chimeric chitinase and Chit42 enzymes imposed 65 and 47% mortality to E. kuehniella larvae, respectively. Finally, microscopic observation demonstrated higher amount of chitin degradation in treated larvae with chimeric chitinase compared with those treated by native Chit42.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chitinase42
  • Chitin binding domain
  • Ephestia kuehniella