ساخت سازه چندمنظوره کلروپلاستی برای ایجاد گیاهان تراریخته تولیدکننده بیوپلیمر زیست‌تخریب‌پذیر و مقاوم به شوری، خشکی و سرما

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

پژوهشگر و عضو هیأت علمی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج

چکیده

چکیده
    هدف از تحقیق حاضر طراحی و ساخت ناقلین اختصاصی انتقال و بیان کلروپلاستی ژن‌های تولید کننده بیوپلیمر و ایجاد تحمل به تنش‌های غیرزنده بود. بدین‌منظور سه ژن درگیر در مسیر بیوسنتزی پلی‌هیدروکسی بوتیرات جداسازی شد و صحت جداسازی و عملکردی بودن ژن‌ها پس از بیان در وکتور بیانی و تولید باکتری نوترکیب تولیدکننده‌ی PHB اثبات گردید. سپس یک کاست بیانی القایی برای این گروه ژنی تحت پیشبر groE و پایانبر Thr طراحی و در راستای نشانگر neo ادغام شده با زیرواحد بزرگ atpB تحت پیشبر و پایانبر کلروپلاستی psbA و بین توالی‌های loxP همسانه‌سازی شد. کاست حاصل در مرکز توالی هدف‌گیری‌کننده کلروپلاستی چهارکیلوبازی که از ژنوم پلاستیدی جهت ایجاد امکان الحاق کاست‌ها به داخل ناحیه بین ژنی trnI/trnA ژنوم کلروپلاستی از طریق نوترکیبی همولوگ جداسازی شده بود، همسانه‌سازی گردید و دو ناقل پلاسمیدی نوترکیب تحت عنوان pFNPi(+) و pFNPi(-) ساخته شد. علاوه‌بر این ژن badh که با رفع سمیّت از بتائین آلدهید علاوه­بر ایجاد مقاومت به شوری، خشکی، سرما به‌عنوان نشانگر غیرآنتی­بیوتیکی نیز قابل استفاده است، پس از حذف اینترون‌ها، بهینه‌سازی کدونی، حذف جایگاه‌های شناسایی آنزیم‌های اندونوکلئاز داخلی که تحت پیشبر Prrn کلروپلاستی و 5’UTR T7gene10 قرار داده شده بود به وکتور کلروپلاستی مذکور اضافه گردید. سازه حاصل تحت عنوان pFBNPi مناسب برای انتقال ژن به باکتری و ژنوم پلاستیدی گیاه بوده و جهت ایجاد گیاهان مقاوم به شوری، خشکی، سرما و تولیدکننده‌ی بیوپلیمر زیست‌تخریب‌پذیر PHB مورد استفاده قرار خواهد گرفت.
 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Construction of a Multifunctional Chloroplast Vector to Make Transgenic Plants Producing Biodegradable Biopolymer and Resistant to Salt, Drought and Cold Stresses

نویسندگان [English]

  • Motahareh Mohsenpour
  • Masoud Tohidfar
Assistant Professor of Agriculture Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Karaj
چکیده [English]

Abstract
The objective of the present study was to design and construction of a specific chloroplast vector to produce biodegradable biopolymers and also induce abiotic tolerance in transgenic plants. To do this, three genes involved in Polyhidroxybutirate biosynthetic pathway were isolated. The genes isolation and functionality accuracy was proved using expression in recombinant E. coli. Then an inducible expression cassette was designed for this operon under control of groE promoter and Thr terminator and subsequently cloned adjacent of neo selectable marker gene integrated with large subunit of atpB under control of psbA promoter and terminator among loxP sequences. The resulting cassette was cloned in the center of a 4Kb fragment from chloroplast genome that makes possibility of transgene targeting into trnI/trnAintergenic region by homologous recombination. These recombinant plastid vectors were called pFNPi(+) and pFNPi(-). Moreover badh gene was added to the chloroplast vector. This gene coding a protein detoxifing Betaine could be used for resistance to salt, drought and cold stresses. After intron removing, codon optimization and remove of internal restriction enzyme recognition sites was placed under Prrn promoter and T7gene10 5’UTR. The final resulting vector called pFBNPi will be suitable for bacteria and plant transformation for production of biodegradable biopolymer and resistant transplastomic plant for salt, drought and cold stresses.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Betaine aldehyde dehydrogenase
  • Chloroplast vector
  • Gene expression in Bacteria
  • PHB biopolymer
Chen, S., Yang, Y., Shi, W., Ji, Q., He, F., Zhang, Z., Cheng, Z., Liu, X. and Xua, M. 2008. Badh2, encoding betaine aldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline, a major component in rice fragrance. Plant Cell, 20: 1850-1861.

Daniell, H. 2002. Molecular strategies for gene containment in transgenic crops. Nature Biotechnology, 20: 581-586.

Daniell, H., Khan, M. and Allison, L. 2002. Milestones in chloroplast genetic engineering: An environmentally friendly era in biotechnology. Trends in Plant Science, 7(2): 84-91.

De Cosa, B., Moar, W., Lee, S. B., Miller, M. and H. Daniell. 2001. Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nature Biotechnology, 19: 71-74.

Derraik, J. G. 2002. The pollution of the marine environment by plastic debris: a review. Marine Pollution Bulletin, 44: 842-852.

Fitzgerald, T. L., Waters, D. L. and Henry, R. J. 2009. Betaine aldehyde dehydrogenase in plants. Plant Biology (Stuttgart), 11(2): 119-30.

Gross, R. A. and Kalra, B. 2002. Biodegradable Polymers for the Environment. Science, 297: 803-807.

Guillet, J. 2002. Plastics and environment. In: Scott G, editor. Degradable Polymers: Principles and Applications. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publisher; pp: 413-448.

Kumar, S., Dhingra, A. and Daniell, H. 2004. Plastid expressed betaine aldehyde dehydrogenasegene in carrot cultured cells, roots and leaves confers enhanced salt tolerance. Plant Physiology, 136(1): 2843-2854.

Lee, S. B., Kwon, H. B., Kwon, S. J., Park, S. C., Jeong, M. J., Han, S. E. and Daniell, H. 2003. Accumulation of trehalose within transgenic chloroplasts confers drought tolerance. Molecular Breeding, 11: 1-13.

Li, R., Zhang, H. and Qi, Q. 2007. The production of polyhydroxyalkanoates in recombinant Escherichia coli. Bioresource Technology, 98: 2313-2320.

Maliga, P. 2005. New vectors and marker excision systems mark progress in engineering the plastid genome of higher plants. Photochemical & Photobiological Sciences, 4: 971-976.

Mohsenpour, M., Babaeianjelodar, N. A. and Tohidfar, M. 2011a. Isolation and Cloning of Three Genes of Polyhydroxybutirate operon producing biodegedable plastic. Journal of Crop Breeding, 3(8): 43-51.

Mohsenpour, M., Babaeianjelodar, N. A. and Tohidfar, M. 2011b. Cloning and expression of PHB biodegradable biopolymer under different regulation elements in recombinant E. coli. Research-Reviews in Polymer. Trade Science Inc. Media for Rapid Publications, India. 3(1).

Mohsenpour, M., Tohidfar, M. and Babaeianjelodar, N. A. 2012a. Design and construction of specific plastid vectors for specific gene targeting to plastomes. Iranian Journal of Crop Sciences, 14 (3): 218-234.

Mohsenpour, M., Babaeianjelodar, N. A., Tohidfar, M. and Mohsenpour, M. 2012b. The Use of Betaine Aldehyde dehydrogenase as a non-antibiotic and safe selective marker in design of plastid vector. Biotechnological journal of Environmental Microorganisms, 6 (3): 55-62.

Mohsenpour, M., Tohidfar, M. and Mohsenpour, M. 2012c. Design of Agrobacterium constructs for production of antibiotic free transgenic plants, salt, drought and cold resistant. Biotechnological journal of Environmental Microorganisms, 6(1): 73-81.

Monde, R. A., Greene J. C. and Stern, D. B. 2000. The sequence and secondary structure of the 3’-UTR affect 30-end maturation. RNA accumulation and translation in tobacco chloroplasts. Plant Molecular Biology, 44: 529-542.

Nikel, P. I., de Almeida, A., Melillo, E. C., Galvagno, M. A. and Pettinari, M. J. 2006. New recombinant Escherichia coli strain tailored for the production of poly (3-hydroxybutyrate) from agroindustrial by-products. Applied and Environmental Microbiology, 72: 39-54.

Robinson, S. P. and Jones, G. P. 1986. Accumulation of glycine betaine in chloroplasts provides osmotic adjustment during salt stress. Australian Journal of Plant Physiology, 13: 659-668.

Ruiz, O. N., Hussein, H., Terry, N. and Daniell, H. 2003. Phytoremediation of organomercurial compounds via chloroplast genetic engineering. Plant Physiology, 132: 1344-1352.

Sambrook, J. and Russel, D. W. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ndedn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.

Saruul, P., Srienc, F., Somers, D. A. and Samac, D. A. 2002. Production of a biodegradable plastic polymer, poly-ß-hydroxybutyrate, in transgenic alfalfa. Crop Science, 42: 919-927.

Slater, S. K., Houmiel, L., Tran, M. T., Mitsky, A. N., Taylor, B. and Padgette, S. R. 1998. Multiple β-ketothiolases mediate poly (β-hydroxyalkanoate) copolymersynthesis in Ralstonia eutropha. Journal of Bacteriology, 180: 1979-1987.

Suriyamongkol, P., Weselake, R., Narine, S., Moloney, M. and Shah, S. 2007. Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms and plants. Biotechnology Advances, 25: 148-175.

Thompson, R. C., Olsen, Y., Mitchell, R. P., Davis, A., Rowland, S. J. and John, A. W. G. 2004. Lost at sea: where is all the plastic? Science, 304: 838.

Zagar, J. 2000. The end of cheap conventional oil. The Proceedings of Energy Efficiency Policy Synoposium. www.hawaii.gov/dbedt/ent/ symposium/zagar.pdf.