مطالعه ساختار ژن دفنسین (Def2) گیاه شنبلیله (Trogonella foenum-graecum) با استفاده از فرم DNA ژنومی و cDNA

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

2 استاد پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

3 کارشناس ارشد پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

چکیده

دفنسین­ ها که جزء خانواده پپتیدی با وزن مولکولی پایین و غنی از سیستئین می‌باشند یک گروه غالب از پروتئین‌های عمل‌کننده غشایی را تشکیل می‌دهند. این پپتیدها در حفاظت از بذر گیاهان در برابر عفونت‌های پاتوژن‌های قارچی نقش مهمی ایفا می‌کنند. در این تحقیق ژن 2Def از گیاه شنبلیله (Trigonella foenum-graecum) شناسایی، همسانه‌سازی و تعیین توالی گردید. بدین‌منظور DNA ژنومی گیاه شنبلیله به روش CTAB استخراج و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی MDeff و MDefr ژن 2Def تکثر شد. قطعه تکثیر شده به طول مورد انتظار 750 جفت باز در ناقل pJET1.2 همسانه‌سازی شد. سازه به‌دست آمده پس از تأیید با الگوهای هضم آنزیمی و PCR به نام pJETME3 نام‌گذاری شد. جهت مطالعه ساختار این ژن، mRNA از جوانه ده روزه گیاه شنبلیله استخراج و cDNA آن سنتز شد. cDNA حاصل به طول مورد انتظار 219 جفت باز در ناقل pJET1.2 همسانه‌سازی و پس از تأیید با استفاده از الگوی هضم آنزیمی و PCR به نام pJETME4 نام‌گذاری شده و جهت تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفت. مقایسه توالی DNA ژنومی و cDNA این ژن نشان داد که ژن 2Def گیاه شنبلیله حاوی یک اینترون به طول 486 جفت باز و Open reading frame آن پپتیدی به طول 72 اسیدآمینه را کد می‌کند. مقایسه توالی اسیدآمینه ای به‌دست آمده از ژن 2Def از گیاه شنبلیله با توالی‌های مرتبط ثبت شده در بانک ژنی مورد مقایسه قرارگرفت و مشابهتی بین 98/6 تا 100 درصد را نشان داد. از این توالی ژنی و cDNA  تأیید شده مربوط به ژن Def2 می‌توان در مراحل تحقیقاتی بعدی جهت انتقال به گیاه کلزا به‌منظور افزایش مقاومت علیه بیماری‌های قارچی استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Structural Analysis of Def2 Gene from Trigonella foenum-graecum by Characterization of Its Genomic and cDNA

نویسندگان [English]

  • Maryam Etebari 1
  • Mostafa Motallebi 2
  • Mohammadreza Zamani 2
  • Zahra Moghaddassi Jahromi 3
1 M.Sc. Student, Institute of Agricultural Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran
2 Professor, Institute of Agricultural Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran
3 M.Sc. Institute of Agricultural Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran
چکیده [English]

Many antifungal peptides including defensins change the fungal membrane potential and ultimately lead to fungal cell death. In this study the genomic DNA from Trigonella foenum-graecum (extracted with CTAB method) and specific primers (MDef-F/R) were used for Def2 containing fragment amplification. The amplified DNA fragment with 750 bp length was cloned into pJET1.2 cloning vector, confirmed by PCR (MDef-F/R primers) and restriction pattern (using XbaI enzyme) and sequenced. Also Def2 cDNA was synthesized with 219 bp length and cloned into pJET1.2. The new construct was confirmed by PCR (MDef-F/R primers) and restriction pattern (using XbaI and XhoI enzymes) and sequenced. Comparison of genomic DNA and cDNA sequences showed that Def2 gene contains one intron with 486 bp length and its ORF codes for a polypeptide with a 72 amino acids length.  Alignment of the amino acid sequence of Def2 peptide shows 98.8 to 100% homology with other reported plant defensin sequences deposited in GenBank. These confirmed that genomic DNA and cDNA of Def2 gene could be used for improvement of antifungal activity of Brassica napus.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Trigonella foenum-graecum
  • Defensin
  • Def2 gene
  • Gene isolation
  • Cloning
Beckers,G. J. M. and Spoel, S. H. 2006. Fine-tuning plant defence signalling: Salicylate versus jasmonate. Plant Biology (Stuttg), 8(01): 1-10.

Broekaert, W. F., Terras, F. R., Cammue, B. P. and Osborn, R. W. 1995. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system, Plant Science, 16: 297-304.

Carvalho, A. O. and Gomes, VM. 2009. Plant defensins prospects for the biological functions and biotechnological properties. Peptides, 30: 1007-1020.

Chen, J. 2004. Cloning and functional expression of a mungbean defensin VrD1 in Pichia pastoris. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(8): 2256-2261.

De Beer, A. and Vivier, M. 2008. Vv-AMP1, a ripening induced peptide from Vitis vinifera shows strong antifungal activity. BMC Plant Biology, 8(1): 75-83.

Doyle, J. J. and Doyle, J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19: 11-15.

Gao,A. G. 2000. Fungal pathogen protection in potato by expression of aplant defensin peptide. Nat Biotechnology, 18(12): 1307-1310.

Hanks, J. N., Snyder, A. K., Graham, M. A., Shah, R. K., Blaylock, L. A., Harrison, M. J. and Shah, D. M. 2005. Defensin gene family in Medicago truncatula: Structure, expression and induction by signal molecules. Plant Molecular Biology, 58(3): 385-399.
Kanzaki, M. 2002. Over expression of the wasabi defensin gene confers enhanced resistance to blast fungus(Magnaporthe grisea)in transgenic rice. TAG Theoretical and Applied Genetics; 105(6): 809-814.

Leah, R. 1991. Biochemical and molecular characterization of three barley seed proteins with antifungal properties. Journal of Biological Chemistry, 266(3): 1564-1573.

Maleck, K. and Dietrich, R. A. 1999. Defense on multiple fronts: how do plants cope with diveRse enemies? Trends in Plant Science, 4: 215-219.

Michaelson, D. 1992. Cationic defensins arise from charge-neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? J Leukoc Biology, 51 (6): 634-63.

Monteiro, S. 2003. Environmental conditions during vegetative growth determine the major proteins that accumulate in mature grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(14): 4046-4053.

Montesano, M. 2003. Pathogen derived elicitoRs: Searching for receptors in plants. Molecular Plant Pathology, 4: 73-79.

Olli, S. and Kirti, P. B. 2002. PCR based cloning of an intron containing defensin gene from Trigonella foenum-graecum L., Direct submission to NCBI, AN: AF535089.

Olli, S. and Kirti, P. B. 2002. RT-PCR based amplification product of the coding region of defensin cDNA from Cicer arietinum. Direct submission to NCBI, AN: AAO38756.

Olli, S. and Kirti, P. B. 2002. RT-PCR based cloning of defensin cDNA from Trigonella foenum-graecum. Direct submission to NCBI, AN: AY182163.

Olli, S. and Kirti, P. B. 2003. RT-PCR based cloning of the coding region of defensin cDNA from Cajanus cajan. Direct submission to NCBI, AN: AAP49847.

Olli, S. and Kirti, P. B. 2006. Cloning, characterization and antifungal activity of defensin Tfgd1 from Trigonella foenum-graecum L., Journal of Biochemistry Molecular Biology, 39(3): 278-83.

Osborn, R. W. 1995. Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae. FEBS Letters, 368(2): 257-262.

Park, H. C. 2002. Characterization of a stamen-specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage. Plant Molecular Biology, 50(1): 57-68.

Pelegrini, P. B. 2008. Novel insights on the mechanism of action of alpha-amylase inhibitors from the plant defensin family. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 73(3): 719-729.

Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001 Molecular cloning. Cold Spring Harbor: New York.

Spelbrink, R. G., Dilmac, N., Allen, A., Smith, T. J., Shah, D. M. and Hockerman, G. H. 2004. Differential antifungal and calcium channel-blocking activity among structurally related plant defensins. Plant Physiology, 135(4): 2055-2067.
Theis, T. and Stahl, U. 2004. Antifungal proteins: Targets, mechanisms andprospective application. Cellular and Molecular Life Sciences, 61(4): 437-455.

Wang, H. and Ng, T. B. 2001. Isolation of a novel deoxyribonuclease with antifungal activity from Asparagus officinalis seeds. Biochemical and Biophysical Research Communications, 289(1): 120-124.

Zhu, Y., Agbayani, R. and Moore, P. 2007. Ectopic expression of Dahlia merckii defensin DmAMP1 improves papaya resistance to Phytophthora palmivora by reducing pathogen vigor. Planta, 226(1): 87-97.