رو ش¬های همسانه سازی ژن بدون آنزیم لیگاز

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان

2 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان

چکیده

همسانه­سازی قطعه DNA موردنظر داخل یک ناقل پلاسمیدی، یکی از مراحل تکنولوژی DNA نوترکیب است. در روش­های معمول برای همسانه­سازی به آنزیم لیگاز و آنزیم­های برشی نیاز است که با محدودیت­هایی مواجه هستند. راه­کارهای متعددی برای ایجاد و اتصال دو قطعه DNA مستقل بدون استفاده از آنزیم لیگاز توسعه یافته­اند که از موفق­ترین آن­ها فناوری­های گیت­وی و یوزرفرندلی هستند. فناوری گیت‌وی روشی سریع و مؤثر برای همسانه‌سازی بر اساس خصوصیت­های نواحی ویژه نوترکیبی باکتریوفاژ لامبدا است. در این فناوری، اجزای سیستم نوترکیب این ویروس برای ایجاد یک سیستم کارآمدتر تغییر یافته‌اند. نوترکیبی بین نواحی ویژه اتصال رخ می­دهد که دو طرف قطعه DNA را احاطه می­کنند. در این فناوری توالی DNA مورد نظر ابتدا در یک ناقل به نام ناقل ورودی همسانه‌سازی می­شود. پس از ایجاد کلون ورودی، انتقال قطعه DNA به ناقل‌های دیگر با واکنش نوترکیبی یک ساعته و بدون استفاده از آنزیم­های برشی و آنزیم­های اتصال دهنده لیگاز به­راحتی انجام می‌گیرد. در فناوری یوزرفرندلی از آغازگرهایی استفاده می­شود که دارای توالی ناقل هستند و یک نوکلئوتید داکسی اوریدین دارند و DNA هدف را با پلیمرازی نظیر تک پلیمراز تکثیر می­کنند. محصول PCR با مخلوط آنزیمی ویژه­ای تیمار می­شودکه انتهای 3َ تک رشته­ای بر روی قطعات DNA تکثیر شده با PCR ایجاد می­کند. با این عمل قطعات DNA داری دنباله­های تک رشته­ای طویل­تر از محصولاتی هستند که با آنزیم­های برشی ایجاد می­شوند و برای اتصال به ناقل به آنزیم لیگاز نیازی نیست. با تغییر در طراحی آغازگرها در این روش همسانه­سازی به راحتی دست­کاری­های مختلف DNA  امکان­پذیر است. در این مقاله به جنبه­های کلیدی و مزایای این روش­ها پرداخته شده است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Gene Cloning Methods Without Ligase Enzyme

نویسندگان [English]

  • Asghar Mirzaie-asl 1
  • Mohammad Reza Abdollahi 2
1 Assistant Professor, Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Bu-Ali sina University, Hamedan
2 Assistant Professor, Department of Agronomy and Plant breeding, Faculty of Agriculture, Bu-Ali sina University, Hamedan
چکیده [English]

The cloning of a DNA fragment into a plasmid vector is a procedure in recombinant DNA technology. The most common methods for cloning require the use of DNA ligase and restriction enzymes which are less efficient. Different Ligation-free  cloning methods have been developed in which of them, Gateway and USER friendly technologies  have been commercialized. Gateway technology is a rapid and efficient method of cloning base on bacteriophage lambda site-specific recombination system. The components of the lambda recombination system are modified to improve the efficiency of the system. Recombination occurs between site-specific attachments. In this technology, a target fragment is cloned into a entry vector. Transfer of DNA from entry vector to other vectors easily can be done without any restriction enzymes and ligase in one hour recombination reaction.  In the USER (uracil-specific excision reagent) Friendly Cloning, vector-specific PCR primers which contain one uracil per primer are designed and the target DNA is amplified with Taq DNA polymerase. The resulting PCR products are treated with the special enzyme to create unique 3´ single-stranded extensions which can then anneal to the supplied linearized vector without ligation enzyme. By varying the design of the PCR primers, the protocol is easily adapted to perform DNA manipulations. In this review key aspects and advantages of these methods are discussed.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Gene cloning
  • Gateway Technology
  • USER Friendly Technology